核盘菌侵染对烟草叶片光合机构的伤害机理

【摘要】核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lid.)deBary)又称为菌核病菌,属于子囊菌亚门,其寄主范围与地理分布非常广泛,是一种世界性的十分严重的植物真菌病害。核盘菌导致的光合机构破坏,光合速率下降是核盘菌侵染导致作物产量下降的直接原因。虽然核盘菌与植物的互作关系已经有不少研究,但是大多集中在核盘菌致病的生化和分子机制,抗性品种的筛选鉴定,抗病基因克隆,以及核盘菌病害的的防治等方面。迄今为止,核盘菌侵染对寄主光合机构的伤害机制仍然是个尚未阐明的问题。本文以烟草品种NC89为实验材料,首先确定了核盘菌侵染过程中对光合机构的伤害主要由草酸(H2C2O4)的C2O42引起,然后通过测定光下烟草叶片光合气体交换,放氧速率,叶绿素荧光快速诱导动力学曲线,叶片820nnm光的反射(MR),过氧化氢(H202)含量及过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶活性的变化等,着重研究了C2O42对烟草叶片光合电子传递,碳同化,光抑制的影响,分析了C2O42-导致烟草叶片光抑制加重的原因并讨论了核盘菌侵染过程中对光合作用的抑制与其侵染过程的关系。主要研究结果如下：(1)核盘菌侵染后导致烟草叶片光合放氧速率和最大光化学效率(Fv/Fm)的显著下降,说明核盘菌侵染严重伤害了光合机构。(2)通过分析比较核盘菌代谢产物H2C2O4和相同pH的H3PO4,HCl对烟草叶片荧光动力学曲线的及荧光参数的影响,发现H2C2O4对光合机构的伤害程度显著大于酸性相同(pH4.0)的H3PO4和HC1,而用相同浓度的中性的K2C2O4溶液处理叶片,发现其对光合机构的伤害程度达到了H2C2O4伤害程度的70%,由此证明核盘菌分泌的C2O42-是导致光合机构伤害的主要原因。(3)比较了不同浓度的K2C2O4溶液(20,40,60mM)对烟草叶片光抑制的影响,并用120mM的KCl作为对照,排除了K+和渗透胁迫的影响。结果表明,处理后Fv/Fm,QA捕获的电子传递到QA以后的效率(Ψo),单位面积有活性反应中心数目(RC/CSm)与对照相比都显著下降,而且随浓度增加下降程度增大,但是对wk没有影响,同时发现K2C2O4处理后的叶片QA不能还原(non-QA)和QB不能还原(non-QB)的反应中心与对照相比都显著增高。证明C2O42-主要伤害了光系统Ⅱ反应中心和受体侧,而对PSⅡ供体测没有影响。(4)当烟草叶片先在强光(800μmolm-2s-1)下进行处理2小时,待发生光抑制后分别用H20,KCl和K2C2O4处理并在弱光(50μmolm-2s-1)下进行恢复,发现K2C2O4处理的叶片基本不能恢复。用PSIⅡ核心蛋白D1蛋白的抑制剂氯霉素(CM)与K2C2O4共同处理叶片,结果显示,在有氯霉素存在的情况下,K2C2O4不能对光系统Ⅱ造成额外的伤害,主要表现为处理后Fv/Fm和甲。与对照叶片没有显著差异。证明C2O42抑制了PSⅡ的修复过程,且主要是抑制了D1蛋白的周转。(5)因为有研究表明活性氧是逆境胁迫下抑制D1蛋白周转,加重光抑制程度的关键因素。所以,我们通过组织染色对K2C2O4处理后叶片中活性氧的变化进行了检测,发现K2C2O4处理后叶片内活性氧含量显著上升。表明C2O42-使烟草叶片光合机构遭受到严重的氧化胁迫。这可能是C2O42-造成D1蛋白周转受抑,加重光抑制的主要原因。而通过测定处理后叶片组织内超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)以及过氧化氢酶的活性发现,SOD活性显著上升,而APX和CAT活性显著下降,这可能也是造成C2O42-处理后叶片内活性氧积累的原因之一。(6)测定了不同浓度的K2C2O4(20,40,60mM)和KCl(120mM)溶液处理烟草叶片对光合二氧化碳响应曲线的影响,结果表明C2O42-同时导致二氧化碳响应曲线的斜率和饱和二氧化碳下的光合速率显著降低,证明C2O42-同时抑制了卡尔文循环的羧化过程和RuBP再生过程。而K2C2O4处理的叶片可溶性糖含量和淀粉含量也显著降低,进一步证明了C2O42-对碳同化的抑制作用。(7)用卡尔文循环的抑制剂碘乙酰胺(IAM)与K2C2O4同时处理叶片后,与对照相比,Fv/Fm与Ψo没有额外增加,表明C2O42-对PSⅡ光抑制的加重是由其对卡尔文循环的抑制作用引起的。(8)通过检测K2C2O4处理后烟草叶片820nm的光反射(MR),证明C2O42-对PSⅠ活性没有影响,但是却对PSⅠ环式电子传递有产生了显著的抑制作用。这可能也是造成活性氧增加,PSⅡ活性受抑的原因之一。(9)病原菌侵染后会导致寄主植物叶片的褪绿,黄萎。为了验证色素降解是否是造成光系统活性下降的原因,我们对处理后叶片内的色素含量进行了测定,发现K2C2O4处理的叶片与氯化钾和对照叶片相比叶绿素a,叶绿素b,类胡萝卜素含量均没有显著改变。这可能是因为在我们的实验中H2C2O4和K2C2O4对叶片的处理时间较短,只有几个小时,还不足以引起烟草叶片中色素含量的降解。因此,表明在短时间内,C2O42引起的光合机构的损伤和光合活性的下降是和叶绿素含量无关的。(10)在黑暗中,K2C2O4长时间处理(大于10小时)也能够造成Fv/Fm,RC/CSm,以及的Ψo下降。这表明,在黑暗中,C2O42-虽然在短期内对光合机构没有显著影响,但是长时间黑暗处理依然能造成光合机构的严重伤害,这可能与C2O42-诱导的程序化死亡(PCD)有关。综上所述,我们的实验证明,在核盘菌侵染过程中,核盘菌分泌的C2O42-是造成寄主植物光抑制加重,光合机构伤害的主要原因。并且主要是通过抑制卡尔文循环的羧化过程和RuBP再生过程,导致电子传递受到抑制,活性氧增多,活性氧又进一步抑制了PSⅡ核心蛋白D1蛋白的周转,从而造成了PSⅡ光抑制的加重。
【作者】杨程；
【导师】高辉远；
【作者基本信息】山东农业大学，植物学，2014，博士
【关键词】核盘菌；H2C2O4；光合作用；PSⅡ；光抑制；活性氧；碳同化；

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